基迪奥生物结题报告

1 项目概述

项目编号	GDR20120491_std_1
样品信息	AM

2 简介

2.1 全长转录组

完整的转录本包括了从5’端到3’端polyA尾的序列，长度集中分布在1-6kb。二代测序技术由于读长较短，得到的测序片段需要拼接，得到的转录本可能会产生拼接错误和较多的嵌合体，从而不能得到完整的转录本。第三代测序技术Pacbio利用单分子实时测序技术（SMRT），由于其超长的读长（平均15kb），无需拼接即可直接获取完整的全长转录本，因此可得到更高质量的转录本，有利于mRNA结构的研究，如可变剪切、融合基因、等位基因表达等。因此，全长转录本的研究越来越热门，发表的文章影响因子也比简单用二代测序RNA-seq要高。
目前第三代测序仪器最主要是美国太平洋生物技术公司（ Pacific Biosciences）的RS II和Sequel。Sequel也是基于单分子实时技术（Single Molecular, Real-Time, (SMRT)）的最新测序平台，其数据产出比RS II提高了约7倍，测序成本更低、项目周期更短。
利用Pacbio三代测序仪进行全长转录组的测序有以下优势：

超长读长：读长最长可达到约80kb，平均8~15kb，轻松解决二代测序所不能解决的重复序列问题；
通量高：RS II平台一个SMRT cell可产生约0.5~1Gb数据，而Sequel平台一个SMRT cell可产生5~10Gb数据；
无GC偏好性：
直接检测碱基修饰：可直接检测各种类型的DNA甲基化。

2.2 实验流程

基于Pacbio Sequel的全长转录组文库不进行片段筛选，每个样本构建一个全库。文库构建整体流程如下图：

Fig 2-2-1 Sequel全长转录组cDNA文库构建整体流程图

本实验采用Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit进行文库构建，具体步骤如下：

RNA样本质检：使用NanoDrop® Series检测样品RNA的浓度；使用Agilent® 2100 Bioanalyzer检测样品RNA的完整度；
第一链cDNA合成：检测合格后的RNA（或poly A+ RNA）使用Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit反转录为第一链cDNA；
PCR扩增合成双链cDNA；
PCR产物纯化：使用AMPure PB Bead对PCR扩增产物进行纯化；
SMRTbell文库构建：包括DNA损伤修复、末端修复、连接Adapter、文库质量评估；
上机测序：将SMRTbell文库退火结合引物和聚合酶，采用MagBead Loading上机测序。

Fig 2-2-2 上机测序示意图

2.3 数据分析流程

数据分析总体流程如下：

	使用SMRT Link V8.0.0^[1]对Sequel2产生的原始数据进行分析。首先从下机数据中提取高质量的CCS序列，移除引物和barcode、poly(A)和连环结构，得到FLNC reads。再对相似的FLNC reads进行聚类，合并成一个完整的isoform。之后，可以对得到的全长转录本进行基因功能注释和结构分析。数据分析总体流程图如下：
Fig 2-3-1 全长转录组（无参）数据分析总体流程图

3 全长转录本分析

3.1 原始数据统计

Tab 3-1-1 subreads统计表
sample	total base(bp)	subreads number	average length	N50
AM	54522359531	26108186	2088	2290

Fig 3-1-1 subreads长度分布图

横坐标表示subreads长度，纵坐标为subreads的数目

3.2 CCS分析

转录本可以在ZMW(zero-mode waveguides，零模波导孔)中循环测序，循环一圈，便可以将转录本的正链，互补链各测一遍，每循环一次叫一个full pass。CCS序列又称为环型一致性序列（Circular consensus sequence），它可经由CCS分析，把多次循环测序的转录本去冗余之后所产生。本报告流程选取下机数据中full passes 数目大于等于1的序列开展CCS分析，最后得到用于后续转录本分析的高精确度CCS reads（又称HIFI reads）。筛选后的CCS序列的数量和长度等信息统计如下：

Tab 3-2-1 CCS分析结果表
Sample	Number of reads	Number of CCS bases	CCS Read Length (mean)	Number of Passes (mean)
AM	700133	1595865928	2279	34


Fig 3-2-1 CCS长度分布图		Fig 3-2-2 CCS passes分布图
x轴表示read长度，左边Y轴为柱形图坐标，表示长度在一定范围内（X轴）的reads数量。右边Y轴为曲线图坐标，表示长度大于一定数值（X轴）的reads数量。		横坐标表示full pass的数目，纵坐标表示含有对应full pass数的CCS序列的数目。

3.3 Reads聚类和校正

我们用Minimap2将相似的FLNC reads进行层级聚类，获取到一致性序列（Unpolished Consensus Isoforms）。然后利用Quiver算法对一致性序列进一步校正，根据输出的序列准确度，获得高质量序列（high quality isoforms，HQ isoforms，预测准确度≥0.99）和低质量序列（low quality isoforms，LQ isoforms，预测准确度<0.99），统计结果如下：

Tab 3-3-1 Cluster分析结果表
Number of polished high-quality isoforms	Number of polished low-quality isoforms
43348	487

Fig 3-3-1 一致性序列长度分布图

横坐标表示聚类得到的一致性序列的长度，左纵坐标表示该长度的序列数量，右纵坐标表示长度大于一定数值（x轴）的序列数量

3.4 转录本的校正

如果有相同样本的二代Illumina测序数据，利用LoRDEC（version 0.8）^[2]对上述低质量序列进行校正。校正后我们取校正覆盖度（二代数据校正的碱基占三代一致性序列的百分比）达99%以上的低质量序列与Quiver校正得到的高质量序列进行合并，得到更准确的转录本，用于后续分析。校正合并后的序列统计表如下：

Tab 3-4-1 校正后序列统计表
Total Number	Total length(bp)	Maximum Length(bp)	Minimum Length(bp)	Average Length(bp)	N50 Length(bp)	GC content
43354	97651496	8282	72	2252.42	2409	43.48%

3.5 序列去冗余

Reads聚类和校正之后，使用软件cd-hit-v4.6.7对一致性序列进行去冗余，将相似度在99%以上的序列合并。采取局部比对的方法，其中，对于较短的序列，比对率必须达到99%，并且比对不上的碱基数要少于30bp；对于较长的序列，比对率必须达到90%，并且比对不上的碱基数要少于100bp。最终得到样本的全长转录组。

Tab 3-5-1 去冗余之后isoform统计表
Total Number	Total length(bp)	Maximum Length(bp)	Minimum Length(bp)	Average Length(bp)	N50 Length(bp)	GC content
34949	77770726	8282	72	2225.26	2385	43.35%

Fig 3-5-1 isoform 序列长度分布图

x轴表示isoform长度，左边Y轴为柱形图坐标，表示长度在一定范围内（X轴）的isoform数量。右边Y轴为曲线图坐标，表示长度大于一定数值（X轴）的isoform数量。

4 基本注释

4.1 注释结果汇总

4. 1. 1 注释汇总统计

基本功能注释信息给出蛋白功能注释、Pathway 注释、COG/KOG 功能注释、Gene Ontology（GO）功能注释等
首先，通过blastx将isoform序列比对到蛋白数据库 nr、SwissProt、KEGG 和 COG/KOG（参数），得到跟给定 Isoform 具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该 isoform 的蛋白功能注释信息。
Nr，SwissProt 是两个著名的蛋白数据库，其中 SwissProt 是经过严格筛选去冗余的。
COG/KOG 是对基因产物进行直系同源分类的数据库，每个 COG/KOG 蛋白都被假定来自祖先蛋白，COG/KOG 数据库是基于细菌、藻类、真核生物具有完整基因组的编码蛋白、系统进化关系进行构建的。
KEGG 是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物的功能的数据库，用 KEGG 可以进一步研究基因在生物学上的复杂行为。

Tab 4-1-1 四大数据库注释统计表
Total Unigenes	Nr	KEGG	KOG	SwissProt	annotation genes	without annotation gene
34949	34636	34467	24307	30551	34660	289

四大数据库注释结果汇总表: /2.basic/All_Unigene.basic.annotation.xls

Fig 4-1-1 四大数据库注释维恩图

4. 1. 2 E值分布统计

将所有 Isoform 在 Nr、Swiss-Prot、KEGG 和 COG/KOG 四大数据库中的最佳比对结果的比对E值进行统计，将其分为 5 个范围，并统计每个范围内的基因个数。比对E值：Isoform 与数据库中匹配序列为同源序列的假阳性概率。

E值统计结果：evalue

KEGG
Nr
Swissprot
KOG

Fig 4-1-2 E值分布图汇总

4. 1. 3 物种分布统计

利用 blastx 将 Isoform 序列与 Nr 数据库进行比对后，取每个 Isoform 在 Nr 库中比对结果最好（E值最低）的那一条序列为对应同源序列（如有并列，取第一条）确定同源序列所属物种，统计比对到各个物种的同源序列数量。

物种分布统计表 : Nr.species.stat.xls

Tab 4-1-2 物种分布统计表
species	number
Eutrema salsugineum	8906
Arabidopsis thaliana	6843
Arabidopsis lyrata	5081
Camelina sativa	3596
Capsella rubella	2731
Brassica napus	2557
Brassica rapa	1175
Raphanus sativus	1116
Brassica oleracea	998
Arabis alpina	152

Fig 4-1-3 各样本物种分布统计图（只展示前十种）

4.2 COG/KOG注释

“COG/KOG”是 Cluster of Orthologous Groups of proteins（蛋白相邻类的聚簇）的缩写。构成每个 COG/KOG 的蛋白都是被假定为来自于一个祖先蛋白，并且因此或者是 orthologs 或者是 paralogs。
Orthologs 是指来自于不同物种的由垂直家系（物种形成）进化而来的蛋白，并且典型的保留与原始蛋白有相同的功能。
Paralogs是那些在一定物种中的来源于基因复制的蛋白，可能会进化出新的与原来有关的功能。
原核生物进行COG注释，真核生物进行KOG注释。

blast 比对 KOG 结果表: /2.basic/COG_KOG/Alyssum_murale.blast.kog.xls
KOG 分类表: /2.basic/COG_KOG/Alyssum_murale.kog.class.annot.xls
KOG 注释表: /2.basic/COG_KOG/Alyssum_murale.kog.gene.annot.xls

4.3 SwissProt注释

blast 比对 SwissProt 结果表: /2.basic/Swissprot/Alyssum_murale.blast.swsp.xls

Tab 4-3-1 blast 比对 SwissProt 结果表
Query_id	Query_length	Query_start	Query_end	Subject_id	Subject_length	Subject_start	Subject_end	Identity(%)	Align_length	Mismatch	Gap	Score	E_value	Subject_annotation
Isoform0000001	8282	404	8113	sp\|F4IVL6\|GRV2_ARATH	2554	1	2552	91.9	2574	182	26	4575.4	0.0e+00	sp\|F4IVL6\|GRV2_ARATH DnaJ homolog subfamily C GRV2 OS=Arabidopsis thaliana OX=3702 GN=GRV2 PE=1 SV=1
Isoform0000001	8282	458	8104	sp\|O75165\|DJC13_HUMAN	2243	3	2230	29.3	2590	1429	403	928.3	2.0e-268	sp\|O75165\|DJC13_HUMAN DnaJ homolog subfamily C member 13 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=DNAJC13 PE=1 SV=5
Isoform0000002	8163	16	7908	sp\|F4I893\|ILA_ARATH	2696	101	2696	90.3	2637	209	47	4222.9	0.0e+00	sp\|F4I893\|ILA_ARATH Protein ILITYHIA OS=Arabidopsis thaliana OX=3702 GN=ILA PE=1 SV=1
Isoform0000002	8163	91	7893	sp\|Q92616\|GCN1_HUMAN	2671	9	2667	31.1	2707	1711	154	1144.0	0.0e+00	sp\|Q92616\|GCN1_HUMAN eIF-2-alpha kinase activator GCN1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=GCN1 PE=1 SV=6
Isoform0000002	8163	91	7893	sp\|E9PVA8\|GCN1_MOUSE	2671	9	2667	31.1	2707	1712	154	1111.3	0.0e+00	sp\|E9PVA8\|GCN1_MOUSE eIF-2-alpha kinase activator GCN1 OS=Mus musculus OX=10090 GN=Gcn1 PE=1 SV=1
Isoform0000002	8163	649	7788	sp\|Q54WR2\|GCN1_DICDI	2667	237	2624	29.8	2459	1577	150	889.0	1.3e-256	sp\|Q54WR2\|GCN1_DICDI eIF-2-alpha kinase activator GCN1 OS=Dictyostelium discoideum OX=44689 GN=gcn1 PE=3 SV=1
Isoform0000002	8163	2206	7869	sp\|Q10105\|GCN1_SCHPO	2670	744	2623	30.3	1933	1249	98	790.0	8.3e-227	sp\|Q10105\|GCN1_SCHPO eIF-2-alpha kinase activator gcn1 OS=Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) OX=284812 GN=gcn1 PE=3 SV=1
Isoform0000002	8163	2902	7788	sp\|P33892\|GCN1_YEAST	2672	941	2587	31.6	1680	1065	84	763.1	1.1e-218	sp\|P33892\|GCN1_YEAST eIF-2-alpha kinase activator GCN1 OS=Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) OX=559292 GN=GCN1 PE=1 SV=1
Isoform0000002	8163	4081	4965	sp\|O94489\|EF3_SCHPO	1047	28	324	33.7	303	187	14	154.5	1.8e-35	sp\|O94489\|EF3_SCHPO Elongation factor 3 OS=Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) OX=284812 GN=tef3 PE=1 SV=1
Isoform0000003	8080	154	6948	sp\|F4I9T0\|BCHB_ARATH	2604	13	2281	90.1	2272	214	10	4088.1	0.0e+00	sp\|F4I9T0\|BCHB_ARATH BEACH domain-containing protein B OS=Arabidopsis thaliana OX=3702 GN=BCHB PE=4 SV=1

4.4 KEGG注释

KEGG（京都基因与基因组百科全书）是基因组破译方面的数据库。在后基因时代一个重大挑战是如何使细胞和有机体在计算机上完整的表达和演绎，让计算机利用基因信息对更高层次和更复杂细胞活动和生物体行为作出计算推测。为达到此目的，人们建立了一个在相关知识基础上的网络推测计算工具。在给出染色体中一套完整的基因的情况下，它可以对蛋白质交互（互动）网络在各种细胞活动起的作用作出预测。 KEGG 的 PATHWAY 数据库整合当前在分子互动网络（比如通道，联合体）的知识，KEGG的 GENES/SSDB/KO 数据库提供关于在基因组计划中发现的基因和蛋白质的相关知识，KEGG 的 COMPOUND/GLYCAN/REACTION 数据库提供生化复合物及反应方面的知识。
KEGG 是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物的功能的数据库，利用 KEGG 可以进一步研究基因在生物学上的复杂行为。根据 KEGG 注释信息我们能进一步得到 Isoform的 Pathway 注释。

Pathway 分析结果报告: /2.basic/KEGG/Alyssum_murale.htm
基因 ID 及对应 KO 号列表: /2.basic/KEGG/Alyssum_murale.ko.txt
基因的 Pathway 列表: /2.basic/KEGG/Alyssum_murale.path.xls
blast 比对 KEGG 结果表: /2.basic/KEGG/Alyssum_murale.blast.kegg.xls

Tab 4-4-1 blast 比对 KEGG 结果表
Query_id	Subject_id	Identity	Align_length	Miss_match	Gap	Query_start	Query_end	Subject_start	Subject_end	E_value	Score	Subject_annotation
Isoform0000001	ath:AT2G26890	91.9	2574	182	7	404	8113	1	2552	0.0e+00	4575.4	GRV2; DNAJ heat shock N-terminal domain-containing protein; K09533 DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13
Isoform0000001	aly:9316911	91.9	2573	182	6	404	8113	1	2550	0.0e+00	4566.9	dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X1; K09533 DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13
Isoform0000001	csat:104752588	91.2	2577	202	5	404	8122	1	2557	0.0e+00	4544.6	dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X3; K09533 DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13
Isoform0000001	csat:104787049	91.1	2574	201	6	404	8113	1	2551	0.0e+00	4531.1	dnaJ homolog subfamily C GRV2-like isoform X1; K09533 DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13
Isoform0000001	crb:17889945	90.8	2572	215	5	425	8119	7	2563	0.0e+00	4516.1	dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X1; K09533 DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13
Isoform0000001	csat:104703503	90.6	2577	215	6	404	8122	1	2555	0.0e+00	4505.7	dnaJ homolog subfamily C GRV2-like; K09533 DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13
Isoform0000001	brp:103829637	89.6	2576	233	7	410	8122	4	2549	0.0e+00	4463.7	dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X1; K09533 DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13
Isoform0000001	bna:106358454	89.9	2565	227	6	443	8122	10	2548	0.0e+00	4463.7	dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X1; K09533 DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13
Isoform0000001	boe:106340730	89.4	2569	241	6	431	8122	3	2545	0.0e+00	4448.7	dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X1; K09533 DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13
Isoform0000001	rsz:108809004	89.2	2582	243	9	392	8122	4	2554	0.0e+00	4446.7	dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X1; K09533 DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13

4.5 Nr注释

blast 比对 Nr 结果表: /2.basic/Nr/Alyssum_murale.blast.Nr.xls

Tab 4-5-1 blast 比对 Nr 结果表
Query_id	Query_length	Query_start	Query_end	Subject_id	Subject_length	Subject_start	Subject_end	Identity(%)	Positive	Gap	Align_length	Score	Subject_annotation
Isoform0000001	8282	404	8113	OAP09465.1	2554	1	2552	92	0.95	0.01	2573	4702	KAM2 [Arabidopsis thaliana]
Isoform0000001	8282	404	8113	NP_180257.3	2554	1	2552	92	0.95	0.01	2573	4698	DNAJ heat shock N-terminal domain-containing protein [Arabidopsis thaliana]
Isoform0000001	8282	425	8095	XP_006293547.1	2565	7	2555	92	0.95	0.01	2564	4684	dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X1 [Capsella rubella]
Isoform0000001	8282	404	8113	XP_020883985.1	2552	1	2550	92	0.95	0.01	2573	4679	dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X1 [Arabidopsis lyrata subsp. lyrata] [Arabidopsis lyrata]
Isoform0000001	8282	404	8122	XP_010473072.1	2557	1	2557	92	0.95	0.01	2576	4663	PREDICTED: dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X3 [Camelina sativa]
Isoform0000001	8282	404	8122	XP_019093469.1	2557	1	2557	92	0.95	0.01	2576	4657	PREDICTED: dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X4 [Camelina sativa]
Isoform0000001	8282	404	8122	XP_019093470.1	2556	1	2556	92	0.95	0.01	2576	4656	PREDICTED: dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X6 [Camelina sativa]
Isoform0000001	8282	404	8113	XP_010510846.1	2553	1	2551	92	0.95	0.01	2573	4648	PREDICTED: dnaJ homolog subfamily C GRV2-like isoform X1 [Camelina sativa]
Isoform0000001	8282	404	8122	XP_006408610.1	2556	1	2556	91	0.94	0.01	2577	4612	dnaJ homolog subfamily C GRV2 isoform X1 [Eutrema salsugineum]
Isoform0000001	8282	404	8122	XP_010417833.1	2555	1	2555	91	0.94	0.01	2576	4603	PREDICTED: dnaJ homolog subfamily C GRV2-like [Camelina sativa]

4.6 GO分类

根据 nr 注释信息我们能得到 GO 功能注释。Gene Ontology（简称GO）是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表（controlled vocabulary）来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。
GO 总共有三个 ontology，分别描述基因的分子功能（molecular function）、细胞组分（cellular component）、参与的生物过程（biological process）。 GO 的基本单位是 term（词条、节点），每个 term 都对应一个属性。
我们根据 nr 注释信息，使用 Blast2GO^[3] 软件得到 Isoform 的 GO 注释信息。Blast2GO 已被其它文献引用超过 150 次，是同行广泛认可的 GO 注释软件。得到每个 Isoform 的 GO 注释后，我们用 WEGO 软件对所有 Isoform 做 GO 功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。

GO 注释表: /2.basic/GO/Alyssum_murale.gene2GO.xls
GO 分类表: /2.basic/GO/Alyssum_murale.GO2gene.xls

Fig 4-6-1 GO 功能分类图

5 高级注释

Isoform 高级功能注释信息给出 Isoform 的 CDS 预测、Pfam 蛋白结构域预测、SMART 蛋白结构域预测、R-Gene预测（植物）、PHI 数据库注释（细菌/真菌）、蛋白质特性及各种翻译后修饰位点预测等等。

5.1 CDS 预测

CDS（Coding sequence）是一段编码蛋白产物的序列，与蛋白质的密码子完全对应。我们首先按照Nr、Swiss-Prot、KEGG 和 COG/KOG 的优先级顺序将isoform与以上蛋白库做blastx比对（evalue小于e-5），取blast比对结果中rank最高的蛋白确定为该isoform的编码区序列，然后根据标准密码子表将编码区序列翻译成氨基酸序列，从而得到该isoform编码区的核酸序列（序列方向5'->3'）和氨基酸序列。最后，跟以上蛋白库都比对不上的isoform用软件ANGEL^[4]预测其编码区，得到其编码区的核酸序列（序列方向5'->3'）和氨基酸序列。

通过blast比对得到的CDS序列: /3.advance/1.CDS/Alyssum_murale.blast.cds.fa
通过blast比对得到的蛋白序列: /3.advance/1.CDS/Alyssum_murale.blast.pep.fa
通过blast比对得到的UTR序列: /3.advance/1.CDS/Alyssum_murale.blast.utr.fa
通过ANGEL预测得到的CDS序列: /3.advance/1.CDS/Alyssum_murale.angel.cds.fa
通过ANGEL预测得到的蛋白序列: /3.advance/1.CDS/Alyssum_murale.angel.pep.fa
通过ANGEL预测得到的UTR序列: /3.advance/1.CDS/Alyssum_murale.angel.utr.fa
CDS预测汇总表格: /3.advance/1.CDS/Alyssum_murale.structure.xls

Tab 5-1-1 CDS预测汇总表格
ID	5UTR start	5UTR end	CDS start	CDS end	3UTR start	3UTR end	Nr-ID	Nr-Score	Nr-annotation	Swissprot-ID	Swissprot-Score	Swissprot-Evalue	Swissprot-annotation	KOG-Protein-or-Domain	KOG-Score	KOG-Evalue	KOG-ID	KOG-Function-Description	KO-ID	KEGG-Evalue	KEGG-Score	KEGG-Gene	Pathway
Isoform0000001	1	403	404	8113	8114	8282	OAP09465.1	4702	KAM2 [Arabidopsis thaliana]	sp\|F4IVL6\|GRV2_ARATH	4575.4	0.0e+00	sp\|F4IVL6\|GRV2_ARATH DnaJ homolog subfamily C GRV2 OS=Arabidopsis thaliana OX=3702 GN=GRV2 PE=1 SV=1	At2g26890	4479.5	0.0e+00	KOG1789	Endocytosis protein RME-8, contains DnaJ domain	K09533//DNAJC13; DnaJ homolog subfamily C member 13	0	4575.4	ath:AT2G26890	--
Isoform0000002	1	75	76	7908	7909	8163	XP_006397389.1	4813	protein ILITYHIA isoform X2 [Eutrema salsugineum]	sp\|F4I893\|ILA_ARATH	4222.9	0.0e+00	sp\|F4I893\|ILA_ARATH Protein ILITYHIA OS=Arabidopsis thaliana OX=3702 GN=ILA PE=1 SV=1	At1g64790	3843.1	0.0e+00	KOG1242	Protein containing adaptin N-terminal region	--	--	--	--	--
Isoform0000003	1	147	148	6948	6949	8080	XP_009102748.1	4252	BEACH domain-containing protein B isoform X1 [Brassica rapa]	sp\|F4I9T0\|BCHB_ARATH	4088.1	0.0e+00	sp\|F4I9T0\|BCHB_ARATH BEACH domain-containing protein B OS=Arabidopsis thaliana OX=3702 GN=BCHB PE=4 SV=1	At1g58230	1885.2	0.0e+00	KOG1787	Kinase A-anchor protein Neurobeachin and related BEACH and WD40 repeat proteins	--	--	--	--	--
Isoform0000004	1	371	372	7625	7626	7989	XP_020875427.1	4197	histone-lysine N-methyltransferase ATXR3 [Arabidopsis lyrata subsp. lyrata] [Arabidopsis lyrata]	sp\|O23372\|ATXR3_ARATH	3360.9	0.0e+00	sp\|O23372\|ATXR3_ARATH Histone-lysine N-methyltransferase ATXR3 OS=Arabidopsis thaliana OX=3702 GN=ATXR3 PE=2 SV=2	At4g15180	2943.3	0.0e+00	KOG1080	Histone H3 (Lys4) methyltransferase complex, subunit SET1 and related methyltransferases	K22748//ATXR3; [histone H3]-lysine4 N-trimethyltransferase ATXR3 [EC:2.1.1.354]	0	3636.3	aly:9304294	;ko00310//Lysine degradation//Amino acid metabolism//Metabolism
Isoform0000005	1	64	65	7720	7721	7953	NP_001320074.1	3848	ribosome 60S biogenesis amino-terminal protein [Arabidopsis thaliana]	--	--	--	--	At4g27010	3678.6	0.0e+00	KOG1791	Uncharacterized conserved protein	K14861//URB1; nucleolar pre-ribosomal-associated protein 1	0	3846.2	aly:9303601	--
Isoform0000006	1	52	53	7441	7442	7827	NP_001189602.1	4483	zinc finger FYVE domain protein [Arabidopsis thaliana]	--	--	--	--	At2g25730	3844.3	0.0e+00	KOG1811	Predicted Zn2+-binding protein, contains FYVE domain	K19027//ZFYVE26; zinc finger FYVE domain-containing protein 26	0	4236.8	ath:AT2G25730	--
Isoform0000007	1	28	29	2140	2141	7649	NP_001323787.1	1081	transducin family protein / WD-40 repeat family protein [Arabidopsis thaliana]	--	--	--	--	At2g46560	1824.7	0.0e+00	KOG1064	RAVE (regulator of V-ATPase assembly) complex subunit RAV1/DMX protein, WD repeat superfamily	--	--	--	--	--
Isoform0000008	1	4327	4328	7609	7610	7684	OAO99106.1	1503	EMB2788 [Arabidopsis thaliana]	--	--	--	--	At4g27010	1446.8	0.0e+00	KOG1791	Uncharacterized conserved protein	K14861//URB1; nucleolar pre-ribosomal-associated protein 1	0	1506.5	aly:9303601	--
Isoform0000009	1	80	81	7529	7530	7658	XP_024010767.1	4771	piezo-type mechanosensitive ion channel homolog isoform X1 [Eutrema salsugineum]	sp\|F4IN58\|PIEZO_ARATH	4544.6	0.0e+00	sp\|F4IN58\|PIEZO_ARATH Piezo-type mechanosensitive ion channel homolog OS=Arabidopsis thaliana OX=3702 GN=At2g48060/At2g48040/At2g48050 PE=2 SV=1	At2g48050	2724.5	0.0e+00	KOG1893	Uncharacterized conserved protein	K22128//PIEZO1_2; piezo-type mechanosensitive ion channel component 1/2	0	4615.4	aly:9318211	--
Isoform0000010	1	1086	1087	7272	7273	7646	XP_024010006.1	3646	mediator of RNA polymerase II transcription subunit 12 [Eutrema salsugineum]	sp\|H3K2Y6\|MED12_ARATH	3510.7	0.0e+00	sp\|H3K2Y6\|MED12_ARATH Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 12 OS=Arabidopsis thaliana OX=3702 GN=MED12 PE=1 SV=1	At4g00450	3159.4	0.0e+00	KOG4522	RNA polymerase II transcription mediator	--	--	--	--	--


Fig 5-1-1 3UTR长度分布图		Fig 5-1-2 5UTR长度分布图

5.2 Pfam 蛋白结构域分析

Pfam（Protein families database of alignments and hidden Markov models ）是一个基于多重序列比对以及隐马尔可夫模型（HMM）预测的方法而收录的大量蛋白质结构信息的数据库，被广泛用来做蛋白结构域预测及蛋白家族分析。
Pfam 包括 PfamA 和 PfamB。其中 PfamA 中所包含的蛋白结构数据都是已知并且得到验证的，每个蛋白结构域都有各自的定义（definition）。而 PfamB 中的数据是通过模型和算法预测出来的，并且未得到验证，是对 PfamA 的补充
Pfam 蛋白结构域的预测是使用 sanger 开发的 Pfam_Scan 程序测 Isoform 编码的蛋白序列后，同 Pfam 数据库进行比对（我们使用的 Pfam 版本号为 26.0），得到Isoform 编码的蛋白结构相关注释信息。

Pfam 蛋白结构相关注释汇总表: /3.advance/2.Pfam/Alyssum_murale.protein.pfamA.xls

Tab 5-2-1 Pfam 蛋白结构相关注释汇总表
seq id	alignment start	alignment end	envelope start	envelope end	hmm acc	hmm name	type	hmm start	hmm end	hmm length	bit score	E-value	significance	clan	PfamA_definition
Isoform0000001	1173	1223	1173	1223	PF14237.6	GYF_2	Domain	1	50	50	41.6	8.1e-11	1	CL0673	GYF domain 2
Isoform0000001	1541	1581	1534	1585	PF00226.31	DnaJ	Domain	11	54	63	43.7	2.3e-11	1	CL0392	DnaJ domain
Isoform0000003	439	610	438	611	PF13385.6	Laminin_G_3	Domain	2	151	152	35.4	1.1e-08	1	CL0004	Concanavalin A-like lectin/glucanases superfamily
Isoform0000003	683	958	682	959	PF15787.5	DUF4704	Family	2	278	279	264.7	8.2e-79	1	No_clan	Domain of unknown function (DUF4704)
Isoform0000003	1556	1648	1538	1650	PF16057.5	DUF4800	Family	154	243	254	38.5	7.5e-10	1	No_clan	Domain of unknown function (DUF4800)
Isoform0000003	1758	1893	1758	1898	PF14844.6	PH_BEACH	Domain	1	95	100	44.8	1e-11	1	CL0266	PH domain associated with Beige/BEACH
Isoform0000003	1936	2212	1935	2212	PF02138.18	Beach	Family	2	276	276	404.4	2.2e-121	1	No_clan	Beige/BEACH domain
Isoform0000004	1936	1988	1853	1988	PF00856.28	SET	Family	111	169	169	40.9	2.7e-10	1	No_clan	SET domain
Isoform0000005	85	380	84	381	PF11707.8	Npa1	Family	2	338	339	169.4	1.3e-49	1	No_clan	Ribosome 60S biogenesis N-terminal
Isoform0000005	1982	2171	1981	2171	PF16201.5	NopRA1	Family	2	201	201	150.9	3.2e-44	1	No_clan	Nucleolar pre-ribosomal-associated protein 1

5.3 SMART 蛋白结构域分析

SMART 蛋白结构域的预测是使用 HMMER - profile hidden Markov models for biological sequence analysis（http://hmmer.org/）程序。
预测isoform 编码的蛋白序列后，同 SMART 数据库进行比对（版本号SMART 06/08/2012），得到isoform 编码的蛋白结构相关注释信息存放在下表中。

SMART 蛋白结构域分析结果表: /3.advance/3.SMART/Alyssum_murale.protein.SMART.xls

Tab 5-3-1 SMART 蛋白结构域分析结果表
GeneID	Length	Domain_Start	Domain_End	SMART_Domain	E-value	Score	Domain-c-Evalue	Domain-i-Evalue	Domain-Score
Isoform0001558	1235	393	579	AAA	3.1e-39	130.6	2.4e-19	2.5e-18	62.9
Isoform0001558	1235	1022	1213	AAA	3.1e-39	130.6	4.2e-20	4.4e-19	65.3
Isoform0001522	1235	393	579	AAA	5e-39	129.9	2.4e-19	2.5e-18	62.9
Isoform0001522	1235	1022	1210	AAA	5e-39	129.9	6.9e-20	7.2e-19	64.6
Isoform0001154	1281	412	601	AAA	1.9e-38	128.0	2e-18	2.1e-17	59.9
Isoform0001154	1281	1064	1255	AAA	1.9e-38	128.0	2.8e-20	2.9e-19	65.9
Isoform0001260	1282	412	601	AAA	2e-38	128.0	2e-18	2.1e-17	59.9
Isoform0001260	1282	1065	1256	AAA	2e-38	128.0	2.8e-20	2.9e-19	65.9
Isoform0001583	1224	333	518	AAA	1e-37	125.7	3.7e-19	3.9e-18	62.3
Isoform0001583	1224	989	1213	AAA	1e-37	125.7	7.8e-19	8.1e-18	61.2

5.4 TF（转录因子）分析

分析的物种是植物或者动物，我们将预测的蛋白序列同相应的 TF 数据库（plant TFdb/animal TFdb）进行 hmmscan 比对。

TF 相关注释汇总表:: /3.advance/4.TF/Alyssum_murale.gene_tf.xls
TF 分类统计表:: /3.advance/4.TF/Alyssum_murale.TF.class.xls

我们将预测的 TF 按照类型分类并作图。（只画数量最多的前10个类型）

Fig 5-4-1 TF 家族分布（前10）

5.5 R-Gene 分析

若分析的物种是植物，我们将预测的蛋白序列同相应的 R-Gene 数据库（PRGdb）进行 blastp 比对。

R-Gene 相关注释汇总表: /3.advance/5.Rgene/Alyssum_murale.protein.RGENE.xls

Tab 5-5-1 R-Gene 相关注释汇总表
Unigene_ID	PRGID	Name	Type	Species	Class	GenBank ID	GenBank Locus	Description	E-value	Score
Isoform0000018	PRGDB00201987	Bra027598	Putative_R-Genes,_predicted_from_Pythozome	Brassica rapa	TNL	--	--	--	0.0	1776
Isoform0000019	PRGDB00206816	LOC_Os10g21950.1	Putative_R-Genes,_predicted_from_Pythozome	Oryza sativa	NL	--	--	--	3e-135	460
Isoform0000022	PRGDB00061511	disease resistance protein	Putative_R-Genes,_collected_from_NCBI_Protein	Brassica rapa subsp. pekinensis	TNL	227438238	FJ842828	Brassica rapa subsp. pekinensis isolate BrTNL10 disease resistance protein gene, complete cds.	1e-60	231
Isoform0000043	PRGDB00206903	LOC_Os02g16090.1	Putative_R-Genes,_predicted_from_Pythozome	Oryza sativa	CN	--	--	--	6e-78	280
Isoform0000104	PRGDB00203241	Carubv10025445m	Putative_R-Genes,_predicted_from_Pythozome	Capsella rubella	N	--	--	--	0.0	3465
Isoform0000116	PRGDB00201779	Bra012688	Putative_R-Genes,_predicted_from_Pythozome	Brassica rapa	TNL	--	--	--	0.0	1264
Isoform0000133	PRGDB00206903	LOC_Os02g16090.1	Putative_R-Genes,_predicted_from_Pythozome	Oryza sativa	CN	--	--	--	5e-79	283
Isoform0000158	PRGDB00147219	Bradi4g25570.1	Putative_R-Genes,_predicted_from_Pythozome	Ricinus communis	CN	--	--	Clathrin, heavy chain (best arabidopsis hit); clathrin heavy chain, putative, expressed (best rice hit)	0.0	621
Isoform0000160	PRGDB00160907	Egrandis_v1_0.003113m	Putative_R-Genes,_predicted_from_Pythozome	Areca catechu	N	--	--	Actin-binding FH2 (Formin Homology) protein (best arabidopsis hit)	2e-105	352
Isoform0000169	PRGDB00147219	Bradi4g25570.1	Putative_R-Genes,_predicted_from_Pythozome	Ricinus communis	CN	--	--	Clathrin, heavy chain (best arabidopsis hit); clathrin heavy chain, putative, expressed (best rice hit)	0.0	617

我们将预测的 R-Gene 按照类型分类并作图。（只画数量最多的前10个类型）分类说明请参考：http://prgdb.crg.eu/wiki/Category:Classes

Fig 5-5-1 R-Gene分类（前10）

5.6 TMHMM 跨膜螺旋结构预测

TMHMM跨膜螺旋结构预测，是使用TMHMM2.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）来预测蛋白的跨膜螺旋结构，寻找可能的膜蛋白。根据蛋白氨基酸序列预测二级螺旋结构，并预测其螺旋结构氨基酸的亲水性与疏水性，来确定跨膜结构螺旋区域（因膜磷脂环境为疏水环境，而膜内外为亲水环境）。

TMHMM 预测结果表: /3.advance/6.tmhmm/Alyssum_murale.protein.tmhmm.xls

Tab 5-6-1 TMHMM 预测结果表
Unigene_ID	Length	ExpAA	First60	PredHel	Topology
Isoform0000415	108	8.86	0.01	0	o
Isoform0000510	100	0.02	0.00	0	o
Isoform0000692	113	34.51	27.68	1	i13-35o
Isoform0004175	102	0.00	0.00	0	o
Isoform0004358	102	0.00	0.00	0	o
Isoform0004424	102	0.00	0.00	0	o
Isoform0004434	102	0.00	0.00	0	o
Isoform0004479	102	0.00	0.00	0	o
Isoform0004521	102	0.00	0.00	0	o
Isoform0004535	472	0.00	0.00	0	o

5.7 SignalP 信号肽结构预测

SignalP信号肽结构预测，是使用SignalP 4.1 Server （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）神经网络方法来预测原核生物和真核生物的蛋白信号肽剪切位点。

SignalP 预测结果表: /3.advance/7.SignalP/Alyssum_murale.protein.SignalP.xls

Tab 5-7-1 SignalP 预测结果表
Unigene_ID	Cleavage_Site	Cmax	C-pos	Ymax	Y-pos	Smax	S-pos	Smean	D	If_SignalP
Isoform0025400	24-25	0.331	25	0.457	25	0.767	19	0.596	0.512	Y
Isoform0034705	29-30	0.718	30	0.732	30	0.986	13	0.798	0.768	Y
Isoform0000009	79-80	0.817	80	0.813	80	0.922	75	0.515	0.694	Y
Isoform0000014	141-142	0.715	142	0.709	142	0.862	143	0.251	0.526	Y
Isoform0000040	75-76	0.778	58	0.736	76	0.853	68	0.331	0.574	Y
Isoform0000104	49-50	0.609	50	0.691	50	0.907	42	0.469	0.602	Y
Isoform0000141	44-45	0.713	45	0.704	45	0.937	97	0.318	0.550	Y
Isoform0000170	58-59	0.741	117	0.657	59	0.777	51	0.379	0.546	Y
Isoform0000194	269-270	0.768	270	0.735	270	0.891	265	0.243	0.538	Y
Isoform0000231	108-109	0.744	109	0.698	109	0.782	102	0.219	0.506	Y

5.8 蛋白O-GlcNAc糖基化位点预测

蛋白O-GlcNAc糖基化位点预测，是使用NetOGlyc 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）神经网络方法预测哺乳动物蛋白的O-GlcNAc糖基化位点。蛋白质的O-GlcNAc糖基化在细胞的生长发育、疾病的发生发展中起着重要的调控作用。

NetOGlyc 预测结果表: /3.advance/8.netOglyc/Alyssum_murale.protein.netOglyc.xls

Tab 5-8-1 NetOGlyc 预测结果表
Unigene_ID	Length	Oglyc_Site	S_num	T_num	S_and_T_num	Oglyc_Site_num
Isoform0001951	1035	--	108	50	158	0
Isoform0001952	581	--	66	22	88	0
Isoform0001953	1012	--	95	51	146	0
Isoform0001954	1187	794T	119	47	166	1
Isoform0001955	547	--	29	29	58	0
Isoform0001956	862	--	100	28	128	0
Isoform0001957	549	--	48	17	65	0
Isoform0001958	1108	24S,26S,27S,28S,29S,30S,31S,32S,34S,37S,38S,42T,43T	85	39	124	13
Isoform0001959	1009	476T	102	35	137	1
Isoform0001960	819	--	61	44	105	0

5.9 ProP 弗林蛋白酶裂解位点预测

ProP 弗林蛋白酶裂解位点预测，是使用ProP 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProP/）神经网络方法预测真核蛋白中的弗林蛋白酶酶切位点——精氨酸和赖氨酸前肽剪切位点。弗林蛋白酶是一种广泛参与前体蛋白切割的内切蛋白酶，能对许多重要的多肽和蛋白的前体进行剪切加工，使之具有生物活性。

ProP 预测结果表: /3.advance/9.prop/Alyssum_murale.protein.prop.xls

Tab 5-9-1 ProP 预测结果表
Unigene_ID	Length	Prop_Site	R_num	K_num	R_and_K_num	Prop_Site_num
Isoform0000001	2570	42R,767R,778R,1272R	149	92	241	4
Isoform0000002	2611	152R,2193R	139	140	279	2
Isoform0000003	2267	1848R	136	111	247	1
Isoform0000004	2418	293R,541R,976R,1445R,2409R	187	177	364	5
Isoform0000005	2552	538R,2228R	109	166	275	2
Isoform0000006	2463	697R,2043R	152	121	273	2
Isoform0000007	704	--	30	33	63	0
Isoform0000008	1094	615K	52	69	121	1
Isoform0000009	2483	--	131	93	224	0
Isoform0000010	2062	14K,697R	144	104	248	2

6 结构分析

6.1 串联重复单元（SSR）

SSR 类型统计表: /4.structure/1.SSR/Alyssum_murale.misa.xls

Tab 6-1-1 SSR 类型统计表
ID	SSR nr.	SSR type	SSR	size	start	end
Isoform0000010	1	p3	(TCT)7	21	69	89
Isoform0000014	1	p4	(TTCT)4	16	31	46
Isoform0000018	1	p3	(ATG)7	21	6969	6989
Isoform0000021	1	c	(TC)6ccttcccttc(CT)6	34	155	188
Isoform0000023	1	p2	(GA)7	14	344	357
Isoform0000025	1	p2	(TC)9	18	187	204
Isoform0000027	1	p3	(GCA)6	18	397	414
Isoform0000028	1	c	(GCAACA)4tcctccaccgctttc(GCA)6	57	343	399
Isoform0000030	1	p3	(TCT)5	15	209	223
Isoform0000032	1	p3	(ATG)8	24	6146	6169

我们将检测到的 SSR 按照短串联重复单元的类型分类并作图


Fig 6-1-1 不同串联重复单元类型的 SSR 在总 SSR 中所占比例的统计图		Fig 6-1-2 SSR 分布图
		X 坐标为 SSR 类型，Y 坐标数值是 m 个碱基重复 n 次发生的次数，具体重复的次数应按照颜色与图例对应，Z 坐标是 SSR 数目

根据找到的SSR信息使用 primer3（ version 1.1.4 ）在SSR序列两侧进行引物设计。对于每一个可设计引物的SSR位点我们提供三种引物设计结果。

SSR 引物设计汇总表: /4.structure/1.SSR/Alyssum_murale.primer.xls

6.2 lncRNA分析

对没有注释到四大数据库的全长转录序列进行lncRNA分析。使用cnci软件^[5]和CPC软件^[6]进行编码能力预测，取两个软件都预测为"非编码"的结果作为最终的lncRNA结果。

Fig 6-2-1 CNCI和CPC预测结果的维恩图

Tab 6-2-1 lncRNA结果统计表
total isoform	the number of mRNA	the number of lncRNA
34949	34728	221

为了更好地在进化层面对lncRNA进行注释，我们用INFERNAL通过多序列比对，二级结构及协方差模型，根据保守序列及二级结构对所有预测lncRNA进行分类。

lncRNA家族预测结果: /4.structure/2.LncRNA/family.xls

Tab 6-2-2 lncRNA家族预测结果
Family_Name	Family_Accession	LncRNA	Strand	E-value	Score

6.3 可变剪切分析

使用软件Cogent^[7]组装出编码序列，然后以组装出来的序列作为参考。使用软件SUPPA^[8]进行可变剪切分析^[9]。


Fig 6-3-1 转录本数目统计		Fig 6-3-2 可变剪切类型统计
该图统计基因含有isoform数目的个数。纵坐标表示含有多少个isoform，横坐标表示含有对应数目isoform的基因个数以及百分比。		横坐标表示可变剪切的类型，纵坐标表示该种可变剪切类型的数量

Tab 6-3-1 可变剪切结果表格
seqname	Type	pos	Strand	total_transcripts
COGENT005184	A3	204-310:204-313	+	Isoform0002774,Isoform0002939,Isoform0002041,Isoform0002887,Isoform0001956,Isoform0002081
COGENT004998	A3	122-183:122-185	+	Isoform0001965,Isoform0002447
COGENT004998	A3	122-179:122-185	+	Isoform0002370,Isoform0002447
COGENT004998	A3	122-179:122-183	+	Isoform0002370,Isoform0001965
COGENT004998	A3	142-196:136-196	-	Isoform0023569,Isoform0030312,Isoform0031625,Isoform0022601
COGENT003699	A3	2397-2501:2397-2514	+	Isoform0003115,Isoform0001689,Isoform0002203,Isoform0002785,Isoform0002297,Isoform0003359,Isoform0004497,Isoform0005387,Isoform0005340,Isoform0006115,Isoform0011939,Isoform0007230,Isoform0008149,Isoform0010159,Isoform0014957,Isoform0019486,Isoform0021497,Isoform0002003
COGENT003698	A3	2561-2665:2561-2678	+	Isoform0001728,Isoform0003115,Isoform0001689,Isoform0002203,Isoform0001568,Isoform0003517,Isoform0001334,Isoform0002785,Isoform0002297,Isoform0003359,Isoform0004497,Isoform0010098,Isoform0005387,Isoform0005340,Isoform0006115,Isoform0011939,Isoform0007230,Isoform0008149,Isoform0010159,Isoform0014957,Isoform0019486,Isoform0021497,Isoform0026778,Isoform0002003
COGENT004797	A3	1271-1356:1271-1362	+	Isoform0002789,Isoform0002125,Isoform0002285,Isoform0002682,Isoform0004505,Isoform0005260,Isoform0007591,Isoform0002353,Isoform0002607,Isoform0002968,Isoform0009855,Isoform0011501
COGENT004799	A3	1271-1356:1271-1362	+	Isoform0002789,Isoform0004505,Isoform0002607,Isoform0002331
COGENT004902	A3	1005-1159:1005-1181	+	Isoform0003293,Isoform0002537,Isoform0004364,Isoform0002526

Gmap 比对结果展示（只展示10个）：

Fig 6-3-3

7 目录结构

├── 1.smrtlink
│   ├── CCS.stat.xls                                                                     CCS分析结果统计表格
│   ├── cdhit.stat.xls                                                                   
│   ├── *ccs_npasses_hist.pdf(png)                                                       CCS passes分布图
│   ├── *ccs_readlength_hist.pdf(png)                                                    CCS长度分布图
│   ├── *consensus_isoforms_readlength_hist.pdf(png)                                     一致性序列长度分布图
│   ├── *fulllength_nonchimeric_readlength_hist.pdf(png)                                 全长非杂合序列长度分布图
│   ├── *hq_lq_isoforms_avgqv_hist.pdf(png)                                              Hq、Lq isoforms平均质量分布图
│   ├── classify.pie.pdf(png)                                                            Reads分类图
│   ├── classify.stat.xls                                                                Classify分析结果统计表
│   ├── cluster.stat.xls                                                                 Cluster分析结果统计表
│   ├── correction.stat.xls                                                              二代矫正三代之后的统计表格
│   ├── isoform_length_distribution.pdf(png)                                             ISOseq 序列 长度分布图
│   ├── rawdata.len.stat.pdf(png)                                                        原始数据长度分布图
│   ├── rawdata_stat.xls                                                                 原始数据统计表
│   └── *_isoforms.fasta                                                                 ISOseq 序列
├── 2.basic
│   ├── 4_database
│   │   ├── 4_database_anno.stat.txt                                                     四大数据库注释统计结果表
│   │   └── venn.svg(png)                                                                四大数据库注释的 Venn 图
│   ├── All_Unigene.basic.annotation.xls                                                 注释结果汇总表
│   ├── COG_KOG
│   │   ├── *.blast.kog.xls                                                              KOG/COG 数据库的blast比对结果
│   │   ├── *.kog.class.annot.xls                                                        KOG/COG 分类文件
│   │   ├── *.kog.gene.annot.xls                                                         KOG/COG 注释
│   │   ├── *.kog.pdf(png)                                                               KOG/COG 分类图
│   ├── evalue
│   │   ├── evalue.KEGG.stat.xls                                                         KEGG 数据库注释中的 E 值分布表
│   │   ├── evalue.KEGG.stat.xls.pie.pdf(png)                                            KEGG 数据库注释中的 E 值分布图
│   │   ├── evalue.KOG.stat.xls                                                          KOG 数据库注释中的 E 值分布表
│   │   ├── evalue.KOG.stat.xls.pie.pdf(png)                                             KOG 数据库注释中的 E 值分布图
│   │   ├── evalue.Nr.stat.xls                                                           Nr 数据库注释中的 E 值分布表
│   │   ├── evalue.Nr.stat.xls.pie.pdf(png)                                              Nr 数据库注释中的 E 值分布图
│   │   ├── evalue.Swissprot.stat.xls                                                    Swissprot 数据库注释中的 E 值分布表
│   │   ├── evalue.Swissprot.stat.xls.pie.pdf(png)                                       Swissprot 数据库注释中的 E 值分布图
│   ├── GO
│   │   ├── *.gene2GO.xls                                                                GO 注释                                                                
│   │   ├── *.GO2gene.xls                                                                GO 分类文件
│   │   └── *.GO.svg(png)                                                                GO 分类图
│   ├── KEGG
│   │   ├── *.blast.kegg.xls                                                             KEGG 数据库的blast比对的结果
│   │   ├── *.htm                                                                        Parhway 分析结果网页报告
│   │   ├── *.ko.txt                                                                     Isoform ID 对应 KO 号列表
│   │   ├── *_map                                                                        Parhway 代谢通路图（文件夹）
│   │   └── *.path.xls                                                                   Pathway 列表
│   ├── Nr
│   │   └── *.blast.Nr.xls                                                               Nr 数据库的blast比对的结果
│   ├── Nr.species.stat.xls                                                              物种分布统计表
│   ├── Nr.species.stat.xls.svg(png)                                                     物种分布统计图
│   └── Swissprot
│       └── *.blast.swsp.xls                                                             Swissprot 数据库的blast比对的结果
├── 3.advance
│   ├── 1.CDS
│   │   ├── 3UTR_length_distribution.pdf(png)                                            3'utr 长度分布图 
│   │   ├── 5UTR_length_distribution.pdf(png)                                            5'utr 长度分布图
│   │   ├── *cds.fa                                                                      预测的cds系列
│   │   ├── *pep.fa                                                                      蛋白序列
│   │   ├── *utr.fa                                                                      utr 序列
│   │   └── *.structure.xls                                                              ISOseq 序列的结构
│   ├── 2.Pfam
│   │   └── *.protein.pfamA.xls                                                          Pfam 蛋白结构相关注释汇总表
│   ├── 3.SMART
│   │   └── *.protein.SMART.xls                                                          SMART 蛋白结构相关注释汇总表
│   │   ├── *.gene_tf.xls                                                                TF 相关注释统计表
│   │   ├── *.head10.TF.pdf(png)                                                         TF统计图
│   │   ├── *.TF.class.xls                                                               TF 分类统计表
│   │   ├── *.TF.pdf(png)
│   ├── 5.Rgene
│   │   ├── RGENE.class.xls                                                              R-Gene 分类统计表
│   │   ├── *.protein.RGENE.pdf(png)                                                     R-Gene 分类统计图
│   │   └── *.protein.RGENE.xls                                                          R-Gene 相关注释统计表
│   ├── 6.tmhmm
│   │   └── *.protein.tmhmm.xls                                                          TMHMM 注释表 
│   ├── 7.SignalP
│   │   └── *.protein.SignalP.xls                                                        SignalP 注释表
│   ├── 8.netOglyc
│   │   └── *.protein.netOglyc.xls                                                       netOglyc 注释表
│   └── 9.prop
│       └── *.protein.prop.xls                                                           prop 注释表
├── 4.structure
│   ├── 1.SSR
│   │   ├── *.misa.xls                                                                   SSR 结果表 
│   │   ├── *.primer.xls                                                                 SSR 引物设计表格
│   │   ├── *.statistics.classify.txt                                                    SSR 分类表
│   │   ├── *.statistics.drawSVG.svg(png)                                                SSR 分布图
│   │   ├── *.statistics.drawSVG.txt                                                     SSR 分布图所用的统计数据
│   │   ├── *.statistics.SSR.pdf (png)                                                   SSR 分类图
│   │   └── *.statistics.totality.txt                                                    SSR 类型统计表
│   ├── 2.LncRNA
│   │   ├── family.xls                                                                   lncRNA家族分析
│   │   ├── lncRNA.fa                                                                    lncRNA序列
│   │   ├── venn.svg(png)                                                                cnci和cpc注释的 Venn 图
│   │   └── lncRNA_stat.xls                                                              lncRNA 统计汇总表 
│   └── 3.AS
│       ├── AS_grap                                                                      可变剪切图片
│       ├── AS.stat.pdf(png)                                                             可变剪切类型统计图 
│       ├── AS.stat.xls                                                                  可变剪切类型统计表 
│       ├── AS.xls                                                                       可变剪切类型表格
│       ├── cogent.cdhit.fa                                                              cogent 组装的序列
│       ├── gmap.out.filter.gtf                                                          ISOseq 比对cogent组装序列的gff 表格
│       ├── isoform.stat.pdf(png)                                                        isoform 统计图
│       └── isoform.stat.xls                                                             isoform 统计表
├── index.html
└── src

8 参考文献

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9 附录

英文方法：无参iso-seq实验和分析方法英文说明文档.pdf
如果您的研究课题使用了基迪奥的测序和分析服务，我们期望您在论文发表时，在Method部分或Acknowledgement部分引用或提及基迪奥公司。可参考以下语句：We thank Guangzhou Genedenovo Biotechnology Co., Ltd in assistance with sequencing and/or bioinformatics analysis.